Переворот оснований ДНК, или переворот нуклеотидов, представляет собой механизм, в котором одиночное основание нуклеотида, или азотистое основание, вращается вне двойной спирали нуклеиновой кислоты[1]. Это происходит, когда ферменту, обрабатывающему нуклеиновую кислоту, требуется доступ к основанию для выполнения работы с ним, например, для его вырезания для замены другим основанием во время репарации ДНК. Впервые он был обнаружен в 1994 году с помощью рентгеновской кристаллографии фермента метилтрансферазы, катализирующего метилирование цитозинового основания в ДНК. С тех пор было показано, что он используется различными ферментами во многих биологических процессах, таких как метилирование ДНК, различные механизмы восстановления ДНК и репликация ДНК. Это также может происходить в двойных спиралях РНК[2] или в интермедиатах «ДНК:РНК», образующихся во время транскрипции РНК.

Cartoon of DNA with a base flipped out
Двойная спираль ДНК с цитозиновым основанием, развернутым на 180°.

Переворот оснований ДНК происходит путем разрыва водородных связей между основаниями и отделения основания от его соседей. Это может происходить в результате активного процесса, когда фермент связывается с ДНК, а затем способствует вращению основания, или пассивного процесса, когда основание спонтанно вращается, и это состояние распознается и связывается ферментом. Его можно обнаружить с помощью рентгеновской кристаллографии, ЯМР-спектроскопии, флуоресцентной спектроскопии или гибридизационных зондов.

Открытие

Переворот оснований впервые наблюдался в 1994 году, когда исследователи Климасаускас, Кумар, Робертс и Ченг использовали рентгеновскую кристаллографию для наблюдения за промежуточной стадией химической реакции метилтрансферазы, связанной с ДНК[3]. Метилтрансферазой, которую они использовали, была C5-цитозинметилтрансфераза из Haemophilus haemolyticus (далее по тексту M. HhaI). Этот фермент распознает специфическую последовательность ДНК (5'-GCGC-3') и метилирует первое цитозиновое основание последовательности в его положении С5[4]. После кристаллизации комплекса M. HhaI-ДНК они увидели, что целевое цитозиновое основание полностью вывернуто из двойной спирали и расположено в активном центре M. HhaI. Он удерживался на месте благодаря многочисленным взаимодействиям между M. HhaI и ДНК[4].

Авторы предположили, что переворот оснований был механизмом, используемым многими другими ферментами, такими как хеликазы, ферменты рекомбинации, РНК-полимеразы, ДНК-полимеразы и топоизомеразы типа II[4]. В дальнейшем было проведено много исследований, и было обнаружено, что переворот оснований является механизмом, используемым во многих биологических процессах, предложенных авторами[5][6].

Механизм

 
Модель Entamoeba histolytica DNMT2 демонстрирует основание, вывернутое из двойной спирали в активный центр метилтрансферазы.

Нуклеотиды ДНК удерживаются вместе водородными связями, которые относительно слабы и легко рвутся. Переворот основания происходит в миллисекундном масштабе[7] путем разрыва водородных связей между основаниями и её отделения от соседей[8]. Основание поворачивается относительно двойной спирали на 180 градусов[9], как правило, через большую бороздку[6] в активный центр фермента. Это событие приводит к небольшим конформационным изменениям в остове ДНК[10], которые быстро стабилизируются усилением взаимодействий фермент-ДНК[6]. Исследования профилей свободной энергии при перевороте оснований показали, что барьер свободной энергии для переворота может быть снижен на 17 ккал / моль для M.HhaI в закрытой конформации.

Существует два механизма переворота оснований ДНК: активный и пассивный[11]. В активном механизме фермент связывается с ДНК, а затем активно вращает основание, в то время как в пассивном механизме поврежденное основание сначала спонтанно вращается, а затем распознается и связывается ферментом[12]. Исследования продемонстрировали оба механизма: урацил-ДНК-гликозилаза следует пассивному механизму[12], а транспозаза Tn10 следует активному механизму[13].

Кроме того, исследования показали, что переключение оснований ДНК используется многими различными ферментами в различных биологических процессах, таких как метилирование ДНК, различных механизмах репарации ДНК, транскрипции РНК и репликации ДНК[14][6][15].

Биологические процессы

Модификация ДНК и восстановление

 
Остаток урацила выходит из двойной спирали ДНК и попадает в карман специфичности урацил-ДНК-гликозилазы.

ДНК может иметь мутации, которые вызывают повреждение основания в цепи ДНК. Чтобы гарантировать генетическую целостность ДНК, ферменты должны восстанавливать любые повреждения. Существует много типов репарации ДНК. В основе процесса эксцизионной репарации оснований используется переворачивание оснований для того чтобы перевернуть поврежденное основание из двойной спирали[6] в активный центр гликозилазы, которая гидролизует гликозидную связь и удаляет основание[16]. ДНК-гликозилазы взаимодействуют с ДНК, переворачивая основания для определения несоответствия. Пример эксцизионной репарации оснований происходит, когда цитозиновое основание дезаминируется и становится урациловым основанием. Это вызывает неправильную пару U:G, которая обнаруживается урациловой ДНК-гликозилазой . Основание урацила выбрасывается в активный карман гликозилазы, где оно удаляется из цепи ДНК[17]. Переворот оснований используется для восстановления таких мутаций, как 8-оксогуанин (oxoG)[18] и димеров тимина, созданных УФ-излучением[19][20].

Репликация, транскрипция и рекомбинация

Репликация ДНК и транскрипция РНК используют переворот оснований[6]. ДНК-полимераза — фермент, осуществляющий репликацию. Его можно представить как руку, сжимающую одноцепочечную матрицу ДНК[21]. Когда матрица проходит через область ладони полимеразы, основания матрицы выворачиваются из спирали и удаляются от сайта связывания dNTP[22]. Во время транскрипции РНК-полимераза катализирует синтез РНК. Во время фазы инициации два основания в промоторе высвобождаются из спирали и помещаются в два кармана в РНК-полимеразе. Эти новые взаимодействия стабилизируют промотор и способствуют разделению или расплавлению нитей ДНК[23].

Переворот основания также происходит на последних стадиях рекомбинации[24]. RecA — это белок, который способствует инвазии цепи[19] во время гомологичной рекомбинации. Переворот оснований был предложен как механизм, с помощью которого RecA может позволить одной цепи распознавать гомологию в дуплексной ДНК[25]. Другие исследования показывают, что он также участвует в рекомбинации V(D)J[26].

Метилирование ДНК

 
Молекула ДНК, метилированная по обеим цепям в центре цитозина.

Метилирование ДНК представляет собой процесс, при котором метильная группа добавляется либо к цитозину, либо к аденину[27]. Этот процесс вызывает активацию или инактивацию экспрессии генов, что приводит к регуляции генов в эукариотических клетках. Известно также, что процесс метилирования ДНК участвует в некоторых типах образования рака[28][29][30]. Чтобы произошла эта химическая модификация, необходимо, чтобы целевое основание вывернулось из двойной спирали ДНК, чтобы метилтрансферазы могли катализировать реакцию[31].

Распознавание мишени эндонуклеазами рестрикции

Эндонуклеазы рестрикции, также известные как ферменты рестрикции, представляют собой ферменты, которые расщепляют сахаро-фосфатный остов ДНК в определённых последовательностях нуклеотидов, которые обычно имеют длину от четырёх до шести нуклеотидов[32]. Исследования, проведенные Хортоном и его коллегами, показали, что механизм, с помощью которого эти ферменты расщепляют ДНК, включает переворот оснований, а также изгибание ДНК и расширение малой бороздки[33]. В 2006 году Хортон и его коллеги представили данные рентгеновской кристаллографии, показывающие, что эндонуклеаза рестрикции HinP1I использует переворот оснований для распознавания своей последовательности-мишени. Известно, что этот фермент расщепляет ДНК по палиндромной тетрануклеотидной последовательности G↓CGC.

Экспериментальные подходы к обнаружению

Рентгеновская кристаллография

 
Рабочий процесс для определения структуры молекулы с помощью рентгеновской кристаллографии

Рентгеновская кристаллография — это метод, который измеряет углы и интенсивности кристаллических атомов, чтобы определить атомную и молекулярную структуру интересующего кристалла. Затем кристаллографы могут создавать трехмерные изображения, на которых можно определить положение атомов, химических связей, а также другие важные характеристики[34]. Климасаукас и его коллеги использовали эту технику для наблюдения первого явления переворота базы, в котором их экспериментальная процедура включала несколько этапов[3]:

  1. Очищение
  2. Кристаллизация
  3. Сбор данных
  4. Определение и уточнение структуры

Во время очистки метилтрансфераза Haemophilus haemolyticus подвергалась сверхэкспрессии и очищалась с использованием стадии обратной экстракции с высоким содержанием соли для селективного растворения M.HhaI с последующей быстрой белковой жидкостной хроматографией (FPLC), как это было сделано ранее Кумаром и его коллегами[35]. Авторы использовали анионообменную колонку Mono-Q для удаления небольшого количества белковых материалов и нежелательной ДНК перед стадией кристаллизации. После того, как M.HhaI был успешно очищен, образец был выращен с использованием метода, который смешивает раствор, содержащий комплекс, при температуре 16 °C и метод диффузии паров висячей капли для получения кристаллов. Затем авторы смогли собрать рентгеновские данные в соответствии с методом, использованным Ченгом и его коллегами в 1993 году[36]. Этот метод включал измерение интенсивности дифракции на детекторе FAST, где время экспозиции для поворота на 0,1° составляло 5 или 10 секунд. Для определения и уточнения структуры Климасаукас и его коллеги использовали молекулярную замену уточненной структуры апо, описанную Ченгом и его коллегами в 1993 г.[36], где поисковые модели X-PLOR, MERLOT и TRNSUM использовались для решения функций вращения и трансляции[37][38]. Эта часть исследования включает использование различных программ и компьютерных алгоритмов для определения структуры и характеристик интересующего кристалла.

ЯМР-спектроскопия

ЯМР-спектроскопия — это метод, который на протяжении многих лет использовался для изучения важных динамических аспектов переворота оснований. Он позволяет исследователям определять физические и химические свойства атомов и других молекул, используя магнитные свойства атомных ядер[39]. Кроме того, ЯМР может предоставить разнообразную информацию, включая структуру, состояние реакции, химическое окружение молекул и динамику[40][41]. Во время эксперимента по открытию переворота основания ДНК исследователи использовали ЯМР-спектроскопию для исследования индуцированного ферментом переворота основания HhaI-метилтрансферазы. Чтобы выполнить этот эксперимент, два остатка 5-фторцитозина были включены в мишень и контрольное положение с ДНК-субстратом, чтобы можно было выполнить анализ химического сдвига 19F . После оценки анализа химического сдвига 19F был сделан вывод, что комплексы ДНК существуют с множественными формами целевого 5-фторцитозина вдоль пути переключения оснований[42].

Флуоресцентная спектроскопия

Флуоресцентная спектроскопия — это метод, который используется для анализа образца с использованием флуоресцентного зонда. Нуклеотиды ДНК сами по себе не являются хорошими кандидатами для этого метода, потому что они слабо излучают свет при световом возбуждении[43]. Для обнаружения переворачивания базы необходим флуоресцентный маркер. 2-Аминопурин представляет собой основание, которое структурно похоже на аденин, но способное к флуоресценции при его отделении от дуплекса ДНК[44]. Он обычно используется для обнаружения переворачивания основания и имеет возбуждение на уровне 305—320.нм и излучение при 370нм так, чтобы он хорошо отделялся от возбуждений белков и ДНК. Другими флуоресцентными зондами, используемыми для изучения переворота оснований ДНК, являются 6MAP (4-амино-6-метил-7(8H)-птеридон)[45] и пирроло-C (3-[β-D-2-рибофуранозил]-6-метилпирроло [2,3-d]пиримидин-2(3H)-он)[46][47] Флуоресцентная спектроскопия с временным разрешением также используется для получения более подробной картины степени переворота основания, а также конформационной динамики, происходящей во время переворота основания[48].

Гибридизационное зондирование

Гибридизационные зонды можно использовать для обнаружения переворачивания оснований. В этом методе используется молекула, которая имеет последовательность, комплементарную последовательности, которую вы хотите обнаружить, так что она связывается с одноцепочечной ДНК или РНК. Несколько зондов гибридизации использовались для обнаружения переворачивания оснований. Перманганат калия используется для обнаружения остатков тимина, которые были высвобождены цитозин-С5 и аденин-N6 метилтрансферазами[49]. Хлорацетальдегид используется для обнаружения остатков цитозина, высвобождаемых ДНК-цитозин-5-метилтрансферазой HhaI (M. HhaI)[50].

 
Добавление гибридизационного зонда к молекуле ДНК

См. также